Gram stain

*목적:

 Gram positive와 Gram negative의 구별

*원리1:

 그람 양성균은 세포벽에 magnessium riboculate라는 산성물질이 존재하여 염기성 염색시약인 crystal violet과 결합하여 alcohol에도 탈색 되지 않는다. 하지만 음성균은 이 산성물질이 세포벽에 없어 alcohol에 의해 탈색된다. 그리고 음성균은 대조염색시약 safranin O에 의해 대조 염색된다.

*원리2:

 그람양성균은 두터운 peptidoglycan층이 세포 밖에 존재하여 crystal violet에 염색이 되고 alcohol에 의해 탈색되지 않지만 음성균은  peptidoglycan층이 지질층에 싸여 있고 양성균에 보다 peptidoglycan층이 얇아 crystal violet이 alcohol에 의해 탈색 되어 대조 염색시약인 safranin O에 의해 대조 염색 된다.(복잡한 화학적인 내용은 생략)

*준비물:
 cystal violet, iodine, 95% ethyl alcohol or 20% acetone alcohol,safraninO, 알코올램프, 루프, 검체, 염색대 등

*방법:

 검체를 슬라이드에 도말 고정(균의 변형과 부퍠방지)한다.

 cystal violet으로 1분간 염색한다.(그람 양성균을 염색하기 위함)

 수세 후 슬라이드를 털어 물기 제거

 iodine으로 1분간 매염한다.(원리1에서는 magnessium riboculate와 crystal violet을 결합시키는 과정이라고 볼 수 있다. 원리 2에서는 crystal violet과 iodine이 불용성 복합체를 형성하는 과정이라 볼 수 있다.)

 수세하고 슬라이드를 털어 물기를 제거한다.

 alcohol로 10초(배양균)~20초(객담)간 탈색한다(원리1에서 양성균은 magnessium riboculate와 crystal violet 이 결합되어 탈색되지 않고 음성균은 탈색된다. 원리2에서 양성균은 peptidoglycan층이 두꺼워 투과성이 낮아 탈색되는 않는 반면 음성균은 peptidoglycan층이 앏은 관계로 투과성이 높아 탈색되며 alcohol에 의해 지질층이 제거된다.)

수세하고 슬라이드를 털어 물기를 제거한다.

 safranin O로 30초간 대조 염색한다.(탈색과정에서 탈색된 음성균을 양성균과 잘 구분하기 위해 대조염색을 하는 과정)

 검경한다.

*결과:
 양성균-보라색(crtstal violet) / 음성균-빨간색(safraninO)

*주의점

 탈색을 오래하거나 대조염색을 오래하면 위 음성이 나올 수도 있으니 주의.