기초실습정리

<panic check와 delta check>

*panic check(경고치 검색) - 빠른 시간 이내에 전문의에게 연락하여야 함

*delta check(변화치 검색) - 환자의 이전 검사치와 현재 검사치를 비교


<항응고제의 종류와 용도>

*Heparin┌Na salts┐- 혈구계산, Hb 정량, 혈전증 치료, 각종 화학검사
             └ Li salts ┘

*Fluorine(NaF) - 혈당검사

*Citrate(3Na salts) - 적혈구의침강속도시험, 수혈응고시험

*EDTA-2Na ┌2K salts┐ - 모든 혈액검사, 혈소판 산정
                  └3K salts┘

*Oxalate (Ammonia salts)
                   (Na salts)      - 응고 검사
                    (K salts)       - 응고 검사

*이중Oxalate┌  K salts  ┐- 혈구계산, Hb, Ht 측정
                    └Na4 salts ┘


<Clean Bench>
 튀거나 공기 중에 떠다닐 수 있는 위험물질이나 균을 가지고 실험할때 사용


<검사보고서 필수 기제 사항>

1. 환자의 이름
2. 병록 번호
3. 검사의뢰 의사
4. 검체 채취 시간과 날짜
5. 보고서가 나간 시간과 날짜
6. 보고되는 검사항목의 참고치
7. 검사자 의뢰서
8. 보고자 의뢰서-해당 부서를 책임지는 전문의
9. 검사 의뢰서-검사일자와 보고일자는 구분한다.
10. Comment


<검사결과에 오차를 유발하는 요인>

1. 불충분한 검체량
2. 항응고제와의 불충분 혼합
3. 용혈
4. 검체의 혼탁
5. 검체보관
6. 시약의 오염(보관, 취급)
7. 시약의 lot변화
8. 기기의 이상
9. 불규칙한 전력
10. 시약의 오용

<원심분리중 규벳파손으로 인한 검체유출 대처법>

1. 원심분리를 중지한다.
2. 뚜껑을 닫은 후 30분 정도 기다려 부유물이 가라앉도록 기다린다.
3. 10배로 락스액을 희석하여 원심분리기 내부를 소독한다.
4. 70% 에탄올로 원심분리기를 닦아 사용한다.

AFB stain

*원리:

 항산성균은 세포벽에 함유되어 있는 다량의 지질 중 mycolic acid라는 특이한 지질은 가지고 있는데, 이 지질이 carbol fuchsin과 결합하여 acid와 alcohol에 탈색되지 않고 염색성을 계속 유지하는 원리를 이용

<Ziehl-Neeson's stain>

*목적:
 항산성균임을 확인하기 위함.

*준비물:
 carbol fuchsin(phenol이 매염제로 들어잇다.), 3% HCl-alcohol, methylene blue, 슬라이드, 루프, 알코올램프, 검체, 화염봉, 염색대

*방법
 균을 슬라이드에 도말 고정하고 염색대 위에 놓는다.

 carbol fuchsin을 슬라이드 위에 붓고  화염봉으로 김이 날 정도만 가온한다.(원리에 의하면 양성균이면 mycolic acid와 carbol fuchsin이 결합 즉 , 균을 염색하는 과정)#가온시 시약이 끓거나 마르지 않도록 한다.(가온을 하는 이유는 지질기를 제거하여 염색이 잘 되게 하기 위함)

 2~3분간 방치(슬라이드를 식히는 중) 후 수세하고 슬라이드를 털어 물기를 제거한다.

 3% HCl-alcohol로 3분간 탈색한다.(양성균은 mycolic acid와 carbol fuchsin이 결합하여 탈색되지 않으나 음성균은 탈색 된다.)

 수세하고 물기를 제거한다.

 methylene blue로 3분간 대조 염색을 한다.(이미 염색된 양성균은 염색되지 않고 탈색된 음성균은 대조 염색된다.

 검경한다.

<형광 염색>
*목적:
 항산성균임을 확인하기 위함

*준비물:
auramin-rhodamine, 3% HCl-alcohol, 0.5% potassium permanganate, 알코올램프, 루프, 검체, 염색대 등

*방법
 검체를 슬라이드에 도말 고정한다.

 슬라이드 위에 auramin-rhodamine를 붓고 약 20분간 염색(균을 염색하는 과정)

 수세 후 물기 제거

 3% HCl-alcohol로 5~10초간 탈색(양성균은 원리에 의해 탈색이 되지 않지만 음성균은 탈색된다.)

 0.5% potassium permanganate로 3분간 처리한다.(과다한 형광물질을 제거하기 위함)

 수세 후 공기 중 건조(여기서 절대 흡습지를 사용하지 말것, 종이에는 다량의 형광물질이 함유되어 있어 위양성이 나올 수 있기 때문)

 형광현미경으로 검경한다.

*결과:
 양성균은 검은 바탕에 녹황색을 띠지만 음성균은 형광현미경으로 보기 때문에 보이지 않는다.

Gram stain

*목적:

 Gram positive와 Gram negative의 구별

*원리1:

 그람 양성균은 세포벽에 magnessium riboculate라는 산성물질이 존재하여 염기성 염색시약인 crystal violet과 결합하여 alcohol에도 탈색 되지 않는다. 하지만 음성균은 이 산성물질이 세포벽에 없어 alcohol에 의해 탈색된다. 그리고 음성균은 대조염색시약 safranin O에 의해 대조 염색된다.

*원리2:

 그람양성균은 두터운 peptidoglycan층이 세포 밖에 존재하여 crystal violet에 염색이 되고 alcohol에 의해 탈색되지 않지만 음성균은  peptidoglycan층이 지질층에 싸여 있고 양성균에 보다 peptidoglycan층이 얇아 crystal violet이 alcohol에 의해 탈색 되어 대조 염색시약인 safranin O에 의해 대조 염색 된다.(복잡한 화학적인 내용은 생략)

*준비물:
 cystal violet, iodine, 95% ethyl alcohol or 20% acetone alcohol,safraninO, 알코올램프, 루프, 검체, 염색대 등

*방법:

 검체를 슬라이드에 도말 고정(균의 변형과 부퍠방지)한다.

 cystal violet으로 1분간 염색한다.(그람 양성균을 염색하기 위함)

 수세 후 슬라이드를 털어 물기 제거

 iodine으로 1분간 매염한다.(원리1에서는 magnessium riboculate와 crystal violet을 결합시키는 과정이라고 볼 수 있다. 원리 2에서는 crystal violet과 iodine이 불용성 복합체를 형성하는 과정이라 볼 수 있다.)

 수세하고 슬라이드를 털어 물기를 제거한다.

 alcohol로 10초(배양균)~20초(객담)간 탈색한다(원리1에서 양성균은 magnessium riboculate와 crystal violet 이 결합되어 탈색되지 않고 음성균은 탈색된다. 원리2에서 양성균은 peptidoglycan층이 두꺼워 투과성이 낮아 탈색되는 않는 반면 음성균은 peptidoglycan층이 앏은 관계로 투과성이 높아 탈색되며 alcohol에 의해 지질층이 제거된다.)

수세하고 슬라이드를 털어 물기를 제거한다.

 safranin O로 30초간 대조 염색한다.(탈색과정에서 탈색된 음성균을 양성균과 잘 구분하기 위해 대조염색을 하는 과정)

 검경한다.

*결과:
 양성균-보라색(crtstal violet) / 음성균-빨간색(safraninO)

*주의점

 탈색을 오래하거나 대조염색을 오래하면 위 음성이 나올 수도 있으니 주의.

균의 동정방법

1. 형태학적 동정: 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하거나 전자현미경으로 관찰하는 등의 방법으로 균의 모습이나 내부의 구조를 관찰하여 균의 특징을 동정하는 방법

2.생리학적 동정:균의 기능을 나타내는 과정이나 원인을 분석하여 그 균의 특성을 통해 동정하는 방법

3.생화학적 동정: 균의 조성이나 균내의 화학반응을 밝혀내여 그 특징을 통해 동정하는 방법

4.면역학적 동정: 항원과 항체의 반응에 의해 균을 동정하는 방법

5.향을 통한 동정: 균을 배양하면서 생기는 그 균의 특징적인 향을 통해 균을 동정하는 방법으로 대표적으로 녹농균을 배양하면 배지에서 향기로운 향이 난다.

6.배지를 통한 동정: 선택배지 또는 감별배지를 통해 배양할려고 하는 균을 선택적으로 배양하여 동정하는 방법. 대표적으로 MAC agar가 대표적이다.

TSI agar(triple sugar iron agar) 설명

TSI는 그람음성균의 당질대사를 확인하기위한 배지이며, 반사면 배지, 선택배지 및 감별배지로 분류 할수 있다. 

Lactose , Sucrose, Dextrose(Glucose) 3개의 당을 10:10:1의 비율로 함유하고 있으며,당의 발효여부를 확인하여 균을 동정한다. Dextrose(Glucose)가 발효되면 butt(밑둥)부분만 산성이 되어 Phenol red라는 지시약에 의하여 노란색으로 변하게 되며, 사면배지 전체가 노랗게 되면 Lactose, Sucrose가 분해된 것이다.

그리고 발효과정 중에 Gas의 생성 여부도 확인 할 수 있다.

또한  배지 내에 Ferrous sulfate가 분해하면 H2S를 생성하여 배지의 butt(밑둥)의 일부 또는 전체가 검정색으로 변한다.

즉, TSI는 당의 발효와 Gas발생 그리고 H2S를 생성 여부를 확인할 수 있다.

<TSI 읽기>

노랑(acid) - A

빨강(alkari) - K

배지 중간이나 밑에의 빈공간(가스 발생) - G

검은 부분이 발생 - H2S

*①/②,③,④       ①,② - A 또는 K(②에 K가 오면 ①에는 A가 올 수 없다.)

                        ③ - G가 오며 가스가 발생하지 않으면 무표기

                        ④ - H2S가 오며 검은부분이 없으면 무표기

-예-

K/K - 어느것도 발효가 되지 않음(배지 전체가 빨강색)

A/A - 모든 당이 발효됨(전체가 노랑)

K/A - Dextrose만 발효됨(butt 노랑, slate 빨강) 

A/K - 이런 경우는 없음

A/A,G - 당이 모두 분해되고 gas가 발생(배지 전체가 노랗고 배지가 떠있거나 빈공간 발생)

A/A,H2S -모든 당이 발효되고 ferrous sulfate가 분해됨(배지 전체가 노랗고 검은부분이 출현)

*만약 밑부분이 모두 검은색으로 덮혀있고 윗부분이 빨강색이면 읽은 수 없다. 즉, 알수 없음